由于明胶空心胶囊具有掩盖药物气味、提高生物利用度和制作缓释试剂等特性，已经成为应用最广泛的药用剂型之一.明胶空心胶囊是采用动物（主要为猪、牛）皮、骨、筋腱中的胶原质，通过部分碱和/或酸解、酶解、热解提纯制得的蛋白质制品.明胶空心胶囊的质量安全一直是世界用药安全问题的焦点，作为蛋白质品，其中细菌的控制尤为重要，因此，灭菌成为整个胶囊生产工艺中必不可少的环节之一.在某些生产工艺中，廉价的环氧乙烷被用作明胶空心胶囊的灭菌剂[2]，环氧乙烷的消毒特性来源于其高挥发性和反应性，这导致环氧乙烷消毒后产生潜在的衍生物，包括1,4-二氧六环、乙醛和卤代乙醇.因此，环氧乙烷在明胶空心胶囊中主要以其衍生物形式存在.2-氯乙醇（2-CE）是环氧乙烷的主要衍生物，也是明胶空心胶囊中最易残留的杂质之一.
欧盟已明确规定禁止使用环氧乙烷对胶囊产品进行熏蒸消毒，并将环氧乙烷和2-CE的最大残留量同时进行限定，但在许多食品检验中，仅观察到2-CE的残留物，不存在环氧乙烷.厂家表明，食品中可能存在2-CE，与非法使用环氧乙烷作为熏蒸剂/消毒剂无关[4].近期通过结构活性关系和体外测试方法验证了2-CE不具备遗传毒性，也不是啮齿动物致癌物[5].因此有必要将2-CE进行单独质量限定以提高检测效率，而不是向环氧乙烷的限度标准看齐.欧洲与中国均对2-CE最大残留量进行严格限定，《中华人民共和国药典》2020版规定：明胶空心胶囊中2-CE限度为20 mg/kg[6]，采用直接进样气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）法对2-CE含量进行测定.但该方法前处理较麻烦，仪器信号不够灵敏，不仅大幅降低了检验效率，还增加了有机试剂的损耗.欧洲对2-CE的最大残留限量尤为严格，采用德国开发的测定2-CE的方法[7]，其将2-CE与环氧乙烷（EO）共同衍生化为2-碘乙醇，再通过气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）方法进行检测[8].2020年，欧盟收到越来越多关于芝麻（特别是印度芝麻）中存在环氧乙烷的通知，要求对所有批次中的50%进行检测.与此同时，基于分散固相萃取样品制备技术（Qu ECh ERS）、固相萃取（SPME）纯化和气相-质谱/质谱（GC-MS/MS）开发了一种更精确、高通量的方法[9]，该方法虽然可以实现2-CE的痕量测定，但是该方法主要用于进口香料、芝麻等食品的测定，操作步骤繁琐，回收率低，不适用于具有胶凝特性的胶囊产品，并且其需要使用MS/MS进行痕量分析，可能在许多实验室中不容易实现.
因此，开发一种适合形势发展的2-CE检测手段尤为重要.本文以2-CE中的氯原子为抓手，以顶空进样方式，建立了气相色谱-离子检测器测定明胶空心胶囊中2-CE含量的方法.将顶空GC-ECD与GC-FID的测定结果进行比较，顶空GC-ECD方法前处理简单、检测灵敏度高，大幅提升了明胶空心胶囊中2-CE含量的检测效率.
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
气相色谱仪，配备HS-20顶空进样器；ECD检测器及FID检测器；色谱柱DB-624(30 m×0.320mm×1.8µm）、色谱柱HP-5(30 m×0.320 mm×0.25µm）、色谱柱HP-INNOWAX(30 m×0.320 mm×0.25µm）；ML304T电子天平；Milli-Q超纯水器.
2-CE对照品溶液（广州佳途科技股份有限公司，批号：202209010035，浓度：5 000 mg/L水溶液）；Na Cl（国药集团化学试剂有限公司，批号：20220107，纯度：99.5%);Na2SO4（国药集团化学试剂有限公司，批号：20221209，纯度：99.0%);NH4Cl（国药集团化学试剂有限公司，批号：20220213，纯度：99.5%）；超纯水；10批来自不同厂家生产的明胶空心胶囊样品.
1.2 试验方法
1.2.1 顶空和色谱条件
顶空条件：顶空平衡温度为90℃，定量环温度为95℃，传输线温度为100℃，顶空平衡时间30 min.
色谱条件：气相毛细管色谱柱DB-624(30m×0.320 mm×1.8µm）；色谱柱温度105℃，维持20min；检测器温度300℃；载气采用氮气；色谱柱流量0.3 m L/min；吹扫流量3.0 m L/min；分流比10∶1.
1.2.2 溶液配制
空白溶液的配制：取Na Cl固体150 g，精密称定，置于500 m L烧杯中，加水至500 m L，搅拌至完全溶解，取5 m L混合溶液于20 m L顶空瓶中作为空白溶液.
对照品溶液的配制：精密量取2-CE对照品溶液40µL，置于50 m L量瓶中，采用含30%Na Cl的水溶液稀释至刻度，振摇，取5 m L混合溶液于20m L顶空瓶中，即得对照品溶液.
供试品溶液的配制：取明胶空心胶囊样品1.0 g，压扁，精密称定，置于20 m L顶空瓶中，加入5 m L含30%Na Cl的水溶液，作为供试品溶液.
纯水对照溶液的配制：精密量取2-CE对照品溶液40µL，置于50 m L量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为纯水对照溶液.
基质溶液的配制：取3份明胶空心胶囊样品各1.0 g，压扁，精密称定，置于20 m L顶空瓶中，加入5 m L纯水对照溶液，作为基质溶液.
2 结果与讨论
2.1 基质效应
分别取3份基质溶液，与纯水对照溶液同时进样，结果如表1所列.
表1 纯水溶液中的基质效应 下载原图
Table 1 Matrix effect of pure aqueous solution
由表1可见，明胶空心胶囊溶于水后基质效应明显，2-CE在胶囊溶液中被明胶所包埋，导致检测时响应信号降低，无法将2-CE完全释放.作为溶剂，纯水也存在沸点低、伤害检测器的问题.因此，本试验采用饱和盐溶液对明胶空心胶囊溶液中的明胶蛋白盐析，使其无法维持三螺旋结构，从而使胶囊溶液失去胶体性质，阻止其包埋2-CE，同时可提高溶剂沸点，减小基质效应的影响.
2.2 盐的选择
按1.2.2项下盐对照溶液处理方法，由于30%盐在水溶液中基本饱和，因此分别选择30%Na Cl、30%Na2SO4、30%NH4Cl作为盐析剂，研究对水基类基质样品的盐析效果.结果如图1所示.
由图1可见，三种盐溶液中Na Cl对明胶胶囊盐析作用效果明显，可有效提高回收率，又考虑到Na Cl溶液获取简单、容易配制、价格低，因此本试验选择Na Cl溶液为盐析试剂.
2.3 顶空条件优化
2.3.1 顶空平衡温度优化
根据《中华人民共和国药典》2020版0861残留溶剂测定法[10]项下说明，顶空平衡温度一般应比溶解供试品所用溶剂的沸点低10℃及以下，能满足检测灵敏度即可.鉴于Na Cl溶液沸点近似为110℃，因此采用90℃作为顶空平衡温度.
图1 30%Na Cl、30%Na2SO4、30%NH4Cl溶液对照与加标峰面积比较 下载原图
Fig.1 Comparison of spiked peak areas of 30%Na Cl,30%Na2SO4,30%NH4Cl salt solutions
2.3.2 顶空平衡时间优化
取1.2.2项下对照溶液各12份，分别在90℃下保温10、20、30、60 min，每组3份，按1.2.1项下方法进样，记录2-CE的峰面积.以峰面积为纵坐标，时间为横坐标作柱状图，结果如图2所示.
图2 2-CE顶空时间考察 下载原图
Fig.2 Study on headspace times of 2-CE
由图2可见，2-CE的峰面积随顶空时间增长而增大，且30 min前测定结果的相对标准偏差（RSD）偏大，可能是顶空瓶中未达到平衡导致结果差距较大，说明2-CE对照品在90℃下，可以在30～60 min达到平衡.由于30 min已达到检测要求，因此综合考虑选择30 min为平衡保温时间.
2.4 色谱条件优化
2.4.1 色谱柱选择
本方法选用3种不同类型的色谱柱对2-CE的分离度、响应和峰形等方面进行评估比较，探究适合该检测方法的色谱柱.分别采用弱极性HP-5毛细管柱、中等极性DB-624毛细管柱、强极性HP-INNOWAX毛细管柱在相同分析条件下，对同一浓度的对照品溶液进行测定.结果显示，HP-INNOWAX柱对2-CE保留效果较强、出峰时间慢，不符合高效检测的改进理念.HP-5柱中，对2-CE几乎不保留，出峰最快，但与溶剂峰相近.而DB-624柱能在15 min内分离2-CE，且峰形尖锐、响应值高，并且可以准确定量.因此，本试验选用DB-624毛细管柱对2-CE进行分析测试，其色谱图如图3所示.
图320µg/g 2-CE对照溶液谱图 下载原图
Fig.3Chromatogram of 20µg/g 2-CE
色谱条件:DB-624(30 m×0.320 mm×1.8µm）色谱柱，105℃柱温，ECD检测器温度为300℃，色谱柱流量为0.3 m L/min
chromatographic conditions:chromatographic column used as DB-624 (30 m×0.320 mm×1.8µm),column temperature of 105°C,temperature of ECD detector of 300°C,flow rate of 0.3 m L/min
2.4.2 检测器选择
本方法比较了2种不同类型的检测器对2-CE的信号灵敏度，分别使用FID与ECD在相同参数条件下，对同一样品溶液进行测定，结果如图4、5所示.
图4 样品溶液在ECD中色谱图 下载原图
Fig.4Chromatogram of sample solution in ECD
色谱条件:色谱柱DB-624(30 m×0.320 mm×1.8µm），柱温105℃，ECD检测器温度为300℃，色谱柱流量为0.3 m L/min
chromatographic conditions:chromatographic column used as DB-624 (30 m×0.320 mm×1.8µm),column temperature of 105°C,temperature of ECD detector of 300°C,flow rate of 0.3 m L/min
图52-CE及样品溶液在FID中色谱图 下载原图
Fig.5Chromatograms of 2-CE and sample solution in FID
(a)2-CE,(b）样品，（1)～(3）均为杂峰色谱条件:DB-624(30 m×0.320 mm×1.8µm）色谱柱，105℃柱温，FID检测器温度为300℃，色谱柱流量为0.3 m L/min
(a) 2-CE,(b) sample,(1)～(3) all impure peaks chromatographic conditions:chromatographic column used as DB-624 (30 m×0.320 mm×1.8µm),column temperature of 105°C,temperature of FID detector of 300°C,flow rate of 0.3 m L/min
由图4、5结果可见，样品溶液在FID下存在杂峰，且杂峰与FID中2-CE对照品出峰时间接近，影响结果的判断.相反，样品溶液在ECD下无明显杂峰，且同浓度的2-CE对照品在ECD检测器中峰形尖锐且明显.因此采用ECD检测明胶空心胶囊中2-CE方法较可靠.
2.5 方法学
2.5.1 线性关系考察
取对照品溶液，按10～35µg/g配制5份不同浓度的对照品标准曲线溶液.以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程：Y=254.3X+921，相关系数r为0.999 4.表明2-CE在10～35µg/g范围内呈良好线性关系.
2.5.2 检测限
将对照品溶液逐步用水稀释，依法进样测定.分别以信噪比（S/N）为10和3确定定量限和检出限，其分别为10和5µg/g.
2.5.3 仪器精密度
取对照品溶液连续进样6次，记录2-CE峰面积，结果显示：2-CE峰面积的RSD为1.90%，表明仪器精密度较好.
2.5.4 重复性
取6份明胶空心胶囊样品各1.0 g，精密称定，添加100%浓度对照品溶液，进样分析，记录2-CE峰面积.结果显示：2-CE峰面积的RSD为1.94%，说明重复性较好.
2.5.5 回收率
精密称取明胶空心胶囊样品各1.0 g，分别添加低、中、高浓度的对照品溶液，每个水平做3次平行试验，按1.2.2项下供试品溶液配制条件，按照1.2.1项下条件进样测定，计算平均回收率，结果如表2所列.
表2 2-CE回收率测定结果 下载原图
Table 2 Determination results of recovery rates of 2-CE
2.6 样品测定
取明胶空心胶囊样品1.0 g，压扁，精密称定，置于20 m L顶空瓶中，加入5 m L含30%Na Cl的水溶液，然后立即压盖密封，置于顶空炉内，按照1.2.1项下条件进样测定，计算样品含量.结果表明所有样品均未检出2-CE，与现有药典方法检测结果一致.
3 结论
本文建立了GC-ECD法对明胶空心胶囊中2-CE残留量进行测定，对现有2-CE测定法进行优化提高，建立科学合理的2-CE测定方法.优化提高后的2-CE测定方法能快速、灵敏测定明胶空心胶囊中2-CE的含量，该研究为2-CE的测定标准提高以及明胶空心胶囊的质量控制提供参考.
