饲料添加剂因其具有使用量少、有效提高饲料的利用率、促进畜禽生长和预防畜禽疾病等特性,被广泛用于畜牧养殖业[1] 。近年来中国的饲料添加剂产业迅速发展,在产生巨大效益的同时也存在一定的安全隐患,如微量元素类添加剂的使用导致环境土壤水体中重金属超标[2] ;药用添加剂的过度使用导致肉奶蛋类中药物残留超标等[3] ,极大威胁动物及人体健康,饲料添加剂的乱用、滥用已成为当前饲料行业亟待解决的一大问题。亟需对饲料添加剂的使用及其残留进行有效监控,对饲料添加剂在饲料及动物可食性产品中的筛查检测技术的探索尤为重要,因此作者综述了饲料添加剂中抗氧化剂、着色剂及严禁在饲料中使用的药物检测方法的研究进展,对目前饲料添加剂检测技术存在的不足进行了分析,阐述了饲料添加剂高通量筛查技术的发展趋势。
1 饲料添加剂
抗氧化剂(antioxidant)能够有效阻止或延缓脂类化合物自动氧化[4] 。目前使用的大多数抗氧化剂多为人工合成,其安全性一直饱受争议。有研究表明,大剂量摄入丁基羟基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA)将导致老鼠前胃发生癌变及DNA的氧化损伤。二丁基羟基甲苯(butylated hydroxyl toluene,BHT)过量摄入会抑制人呼吸酶活性,诱发癌症和畸形[5] 。为增加家禽蛋黄、皮肤、羽毛、喙和水产动物肌肉的色泽,诱导水产动物进食,着色剂(colorant)被广泛使用[6] ,但随之而来的是蛋中苏丹Ⅳ和鱼肉组织中日落黄等有害物质超标,诸如此类的食品安全事故频发,对消费者人身安全造成了严重威胁。
随着规模化养殖的发展,非治疗目的的促生长和预防用药日益增多。中国农业部2010年修订了《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》[7] ,该目录虽明确规定了禁止使用的药物品种,但违禁药物的使用仍屡禁不止,因此有效的添加剂残留检测方法的建立是监督、控制添加剂滥用的关键。
2 样品前处理技术
样品前处理技术(sample pretreatment technology)是指将试样进行物理或化学处理后,在排除其他组分干扰的同时将待测组分从样品中提取出来,同时将待测组分稀释、浓缩或转化成符合仪器测定要求的状态。目前前处理技术的发展趋势在于速度快、批量大、成本低、消耗污染小、自动化程度高、方法准确可靠等,这也是评价前处理技术的相关标准[8] 。
2.1 固相萃取技术
固相萃取技术(SPE)是目前最常用的样品净化手段,根据化合物的理化性质,选择不同种类的固相萃取柱来去除杂质净化样品。该技术吸附剂选择性较高,一般分为正相、反相和离子交换型吸附剂及一些新型的吸附剂[9] 。试验中常对这3类吸附剂进行比较从而得到最佳试验方案,如在对色素的检测中,Sun等[10] 对C18柱、中性氧化铝、Oasis MCX及Oasis HLB柱进行比较,结果表明中性氧化铝的效果最差,C18柱效果最好,回收率在72.89%~119.5%之间。张璐等[11] 利用C18柱净化提取了食品中的13种抗氧化剂,平均回收率为80.5%~118.8%,并对PSA、Florisil、LC-C18这3种小柱进行比较,结果发现在PSA柱上,大部分抗氧化剂无保留,在Florisil柱上,大部分抗氧化剂的回收率在60%以上,但特丁基对苯二酚(TBHQ)和BHT在通过净化后没有回收率,C18柱效果最佳。孙婷等[12] 采用碱性乙腈作为提取试剂,提取液经Oasis MCX固相萃取柱净化后,利用液质联用技术,检测了猪肉中20种精神药物,平均回收率为66.8%~97.2%。
传统固相萃取吸附剂存在吸附选择性较差、吸附容量低且重复使用率低等问题,为此一些新型吸附剂正在逐渐被开发利用,如纳米粒子、生物材料、分子印迹聚合物、免疫吸附剂等。常见的纳米粒子有碳纳米管(CNTs)、金纳米粒子、Fe3O4磁性纳米粒子等。纳米粒子比表面积大、化学性质稳定、热稳定,被广泛用于违禁类添加剂的检测。Zhao等[13] 利用碳纳米管对食品中的巴比妥类药物进行提取,回收率为75%~104%。对碳纳米管表面进行改性及功能化,引入不同的官能团后,可以实现高效选择性萃取,在抗生素[14] 和违禁药物β-激动剂检测[9] 的提取方面颇有成效。磁性纳米材料具有操作简单,能反复利用等独特优势,目前广泛应用于金属离子[15] 、酚类物质[16] 、杀虫剂[17] 及药物残留检测。分子印迹固相萃取技术(MI-SPE)发展迅速,但存在吸附容量低、抗大分子干扰能力差、水相中选择性差及模板分子渗漏等问题。为解决这些问题,开发了纳米分子印迹聚合物、限进介质—分子印迹聚合物、水相识别分子印迹聚合物等新型MIPS材料,其中纳米MIPS材料备受关注,但在饲料添加剂检测领域很少应用。生物吸附法是用某些生物体及其衍生物去除水溶液中的金属离子或有机污染物的一种方法,但其受到众多环境因素的干扰较大,应用也很有限,在饲料添加剂检测领域尚未涉及[18] 。
2.2 基质固相分散
基质固相分散(matrix solid-phase dispersion extraction,MSPD)技术将浓缩样品匀化、提取和净化等步骤于一体,操作更为简易的同时避免了因多种步骤引发的样品损失[19] 。目前该技术已被用于各种环境基质多种污染物,包括杀虫剂农药[20] 、兽药[21] 、天然毒素[22] 等分析检测。在饲料色素检测方面,Zou等[23] 利用MSPD对动物饲料和肉中的色素进行了提取净化,减少了杂质的干扰,试验回收率可达71%~97%,效果良好。
目前涌现了很多新型MSPD吸附材料,如碳材料、分子印迹聚合物、离子液体和纳米粒子材料等[24] 。Zhu等[25] 合成了一种RP/弱阳离子交换的硅基和烷基羧基组复杂的(硅-WCX)材料,应用于猪肝脏中克伦特罗和莱克多巴胺的吸附,效果良好。Judith等[26] 利用分子印迹聚合物MSPD萃取技术对羊奶中的类固醇激素进行了跟踪分析,该方法的回收率可达81%~110%,不足在于定量限(LOQs)较高。Wang等[27] 利用离子液体MSPD技术———液液微萃取技术提取了调料中的4种合成染料。该方法中样品和有机试剂的使用量很少,萃取时间短,回收率较高仅略低于超声波萃取。Su等[28] 利用多壁碳纳米管基质固相分散萃取技术提取出食品中的8种激素类药物,回收率达84.5%~111.2%,与其他技术相比更为简单、快捷。
2.3 固相微萃取
固相微萃取(solid-phase micro extraction,SPME)技术是在SPE技术的基础上发展而来的,可以实现高沸点化合物的快速进样,操作简单,富集程度自动化程度高。搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction,SBSE)在固相微萃取技术上发展而来,操作更为简单。该技术实质是将涂有萃取相的磁性搅拌子置于样品溶液中,磁力搅拌萃取,解吸后上样检测,避免了SPME中萃取相与搅拌子之间竞争吸附的问题。在违禁饲料添加剂的检测中也有部分应用,如Wang等[29] 制备了一种莱克多巴胺分子印迹涂层搅拌棒,与电化学发光技术联用检测猪肉中的莱克多巴胺,回收率达99.7%~115%,合成的分子印迹涂层搅拌棒制作简单,具有极高的选择性和稳定性,该方法不仅适用于猪肉组织也适用于其他的动物组织。Xu等[30] 利用该技术提取莱克多巴胺,效果良好,该团队还设计了一种双属性分子印迹涂层搅拌棒检测水体里5种雌激素[31] ,搅拌棒能重复使用50次,可长时间保存,回收率达71.2%~96.4%,该方法可以简单有效应用于多种雌激素的提取。
2.4 液相微萃取
液相微萃取(liquid-phase micro extraction,LPME)技术采用微量溶剂置于被搅拌或流动的溶液中,从而实现目标物的微萃取。目前已有多种技术,如分散液液微萃取(DLLME)、连续流动微萃取(CFME)、中空纤维液相微萃取(HF-HPME)、悬滴液相微萃取(SDME)。杨清[32] 利用涡旋辅助超分子溶剂液液微萃取—高效液相色谱法测定了食品中的叔丁基对苯二酹和BHA这2种抗氧化剂,回收率为92.7%~102.1%,有良好的重现性。常见的分散LPME技术中常使用剧毒的溶剂,并不符合环境友好原则,新的分散LPME也应运而生,即DLLME-SFO技术,不仅实现了低毒,与其他方法相比操作更简单,该技术应用于液体样品中固醇类激素检测效果显著。Chang等[33] 利用分散液液微萃取对水样中的雌二醇、炔雌醇等7种激素进行了提取,回收率达87%~106%,DLLME-SFO是一种检测微量样品的方法,具有操作简单、快速、廉价和低毒等优点。
2.5 其他前处理技术
除了上述较为常用的前处理技术外,还有一些其他新型技术正在发展。超临界流体萃取(supercritical fluid extraction,SFE)是利用压力对超临界流体的溶解能力的影响而进行萃取,操作过程简单便捷,能有效降低有机溶剂的使用,应用领域十分广泛。常用的超临界流体有:乙烯、乙烷、CO2和NH3等,最常用的是CO2,适于萃取烃类及非极性脂类化合物,如醚、酯和酮等,该方法也适用于激素类检测。Fatemeh等[34] 将MSPD-SFE与超分子溶剂微萃取相结合,对血液中的左炔诺孕酮和甲地孕酮进行了检测,有效的结合了2种萃取方式的优点,对于拥有复杂基质的药物的净化效果显著。超分子溶剂微萃取是一种消耗更少的有机溶剂和高浓缩的萃取方法,这3者的结合解决了操作时间长、消耗有机溶剂量大和检测限(LOD)受限等问题,对于非极性及基质复杂的药物萃取有很好的效果。目前该技术多用于农药残留检测,在添加剂检测领域涉及较少,该技术常常与其他前处理技术相结合从而达到更好的检测效果。加速溶剂萃取技术(accelerated solvent extraction,ASE)是在提高温度和压力的条件下,用有机溶剂萃取,从而达到对目标分析物的预富集。Choi等[35] 利用加速溶剂萃取技术结合d-SPE技术从饲用血粉中提取了多种镇静剂和肾上腺素能受体阻滞剂。有一种气相方法结合ASE和SPE检测了猪肉中巴比妥、异戊巴比妥和镇静安眠剂残留[36] ,这为3种巴比妥盐的明确识别、量化提供了方法。
新型样品前处理技术研发是添加剂检测的研究热点。近年来,SPE、SPME和LPME等新型样品前处理技术已得到广泛的应用。与传统方法相比,新型样品前处理技术萃取效率高、速度快、有毒有害有机溶剂用量少、易于实现自动化操作等。多种萃取技术的结合使用及绿色、经济、微型化、自动化的样品前处理技术成为今后研究发展的趋势。
3 检测方法
3.1 高效液相色谱法
高效液相色谱法(HPLC)因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高、对样品的适用性广、不受分析对象挥发性和热稳定性的限制等特点,广泛应用于饲料添加剂的检测,但目前存在检测种类较少及前处理方法陈旧等不足。张曼等[37] 测定了饲料中8种抗氧化剂,自动固相萃取后经高效液相色谱—梯度淋洗—二极管阵列检测器检测,回收率为84%~106%,该方法灵敏度、准确度、可靠性高。杨春林等[38] 建立了同时测定饲料中4种酚类抗氧化剂和3种防腐剂的HPLC方法。7种物质浓度在0.1~100.0μg/mL时与峰面积呈良好的线性关系,检出限(3S/N)为0.027~0.102 mg/L,平均回收率为79.62%~112.29%。食品中的抗氧化剂检测则相对较多,如Wang等[39] 利用HPLC-FLD技术结合化学计量方法实现了食用油中的酚类抗氧化剂的检测,在6min内成功洗脱10种抗氧化剂,有机溶剂消耗少,无萃取和衍生化等复杂步骤,检测速度快,灵敏度高。
国家标准化检测方法中也大量利用HPLC检测色素类残留,如河豚鱼、鳗鱼和烤鳗鱼中角黄素残留量采用液相色谱紫外检测法进行测定及饲料中叶黄素采用HPLC测定等;张华等[40] 采用HPLC以乙腈—甲醇为流动相单独检测饲料中角黄素;目前应用HPLC对动物源性食品中斑蝥黄检测较多[41,42] 。曹小妹[6] 利用HPLC在6 min内测定了饲料中叶黄素、斑蝥黄和β-胡萝卜素,LOD为0.020~0.250μg/mL,回收率为76.7%~105.0%,这一研究弥补了饲料中添加剂检测方法的缺失、检测种类较少和检测时间较长的不足。
3.2 液相色谱串联质谱技术
饲料添加剂的高通量筛查检测方法统计表明,液相色谱串联质谱技术(LC-MS)应用最为广泛,约占38%,其次是紫外检测器(LC-UV)和酶联免疫分析法(ELISA),各占18%,其他技术占20%[43] 。LC-MS/MS联用技术优势明显,适用于不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子量化合物的分析测定,具有准确度、灵敏度高,选择性好、操作简便等优点。
目前,抗氧化剂的检测研究多集中于食品中抗氧化剂检测。Hao等[44] 用LC-MS测定了食用油中的TBHQ,回收率达81.9%~110.5%,检出限为0.3mg/kg。唐丽娜等[45] 利用LC-MS检测了食品中的4种抗氧剂成分,方法灵敏重现性好。李秀勇等[46] 测定了10种抗氧化剂,平均回收率为92.56%~102.5%,检出限为2~10g/L。与之相比,张璐等[11] 则测定了食品中13种抗氧化剂,检测种类在不断增加。饲料中抗氧化剂的检测研究则相对较少,林安清等[47] 对饲料中BHA、没食子酸辛酯(OG)、丙二醇(PG)、TBHQ、没食子酸十二酯(DG)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)这6种抗氧化剂进行了检测,最低检测限为2 mg/kg。饲料中着色剂的检测研究较少,Liu等[48] 利用超液相色谱串联质谱技术(UHPLC-MS/MS)对饲料中的非法染料进行了检测,回收率为60%~140%,定量限为0.01~5.61μg/kg,该方法可用于定性和定量技术同时测定动物饲料和家禽产品的非法染料。目前,色素类检测在食品行业应用广泛。Li等[49] 利用高效液相色谱—二极管阵列检测器/离子阱飞行时间串联质谱(HPLC-DAD-IT-TOF/MS)技术检测了食品中34种水溶性合成色素,检测范围为0.01~0.05μg/mL,回收率为76.1%~105.0%。
研究表明HPLC广泛应用于多种药物的筛查。国家标准化检测方法和行业标准中对禁止添加的镇静剂类添加剂均使用LC-MS进行检测[50,51] 。Mark等[52] 利用LC-MS/MS技术检测了14种禁止在猪和家禽配合饲料中添加的药物添加剂,在100μg/kg水平能有效验证并分析此水平的化合物。严丽娟等[53] 利用超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱,在9min内对20种镇静剂进行高通量筛查和定量分析。检出限为0.3~1.5μg/L,定量限为1~5μg/L,平均回收率为76.1%~108.2%。Shao等[54] 利用高效液相色谱—电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)检测了动物可食性组织中多种β-激动剂,该方法能在一次单一运行中有效检测出16种β-激动剂。2014年Mauro等[55] 同时测定了18种β-激动剂,随着技术的进步,可测的种类在逐渐增加。Deng等[56] 采用液相色谱—四级杆/飞行时间串联质谱(LC-Q-TOF-MS)方法测定肉、奶和蛋中苯并咪唑类、类固醇激素类等9类105种兽药残留。LC-MS技术在兽药多残留的筛选中广泛十分应用,并朝着检测药物种类更多、操作简单、更加灵敏和效率更高的趋势发展。
3.3 ELISA法
ELISA方法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法。涂顺等[57] 建立了苏丹红Ⅰ酶联免疫吸附检测方法。邱凯等[58] 基于单克隆抗体,建立了测定食品中柠檬黄的间接竞争ELISA分析方法,最低检测限达26.34ng/mL。目前,ELISA方法检测动物可食性产品和饲料中违禁药物的检测限和灵敏度很高[59] 。李瑞园等[60] 建立了饲料中己烯雌酚定量的ELISA法,样品回收率为76%~94.2%,该方法灵敏度高,适用于大批量样品的筛选。目前,市面上已出现饲料中盐酸克伦特罗测定试剂盒,但其提供的待测物组成或结构方面的信息少,结果易出现假阳性,需要进一步确证。李静宇等[61] 制备出性能优异的克伦特罗荧光免疫层析快速定量检测试纸条,为实现其产业化应用奠定基础。对于高通量筛查来说,该方法存在很大的局限性,检测样品下限浓度不够低,灵敏度不高,很难定量的一次性检测同一个分析体系中的不同检测信号,而且微量化、自动化、高通量化程度都不高等缺点[62] 。
4 小结
中国添加剂检测技术研究相对滞后,检测技术水平较低、方法可靠性不高、检测的品种和范围有限、检测标准严重缺乏、针对饲料中使用违禁添加剂的预警与风险分析体系不健全等,这些都给饲料添加剂有效安全监测的执行上带来困难。随着技术的发展,在采用传统前处理技术的基础上,结合新的前处理萃取技术,开发新的提取溶剂和提取方法,建立高效、快速、灵敏、对环境污染少的新的前处理方法为多种饲料添加剂的检测提供了可能,仪器检测技术的快速发展更是为中国饲料添加剂检测奠定了基础。
