塑化剂是一种被广泛应用于塑料制品的用于增强柔韧性的材料助剂。商品化的塑化剂多达100余种,其中邻苯二甲酸酯类塑化剂(phthalic acid esters,PAEs)最为常见,超过塑化剂总量的80%[1,2,3]。2011年台湾塑化剂污染食品事件(污染产品500余项)以及2012年大陆白酒塑化剂污染风波使食品中的塑化剂污染问题备受关注[4]。PAEs作为塑化剂的代表性物质,被广泛用于塑料、汽车、化妆品、农药等行业,可通过挥发、迁移等途径进入空气、土壤、水体、生物体中[5]。研究证明PAEs是一种环境激素类物质,可以代替天然激素作用于机体,导致男性雌性化,降低生殖能力,引发女性性早熟,增加乳腺癌风险。此外,PAEs可引起生物体细胞染色体结构和数目的变化,具有致畸、致癌等诸多危害[6,7,8]。其中,邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di-(2-ethylhexyl)phtha-late,DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)等被联合国出版的《全球化学品统一分类和标签制度》列于1B(具有致癌、致突变或生殖毒性)分类中[9]。我国国家食品药品监督管理总局在2016年12月发布了关于PAEs的食品国家标准,对食品中PAEs含量限制范围做了明确规定[10],其中食品和食品添加剂中DEHP、DBP、邻苯二甲酸二异壬酯(diisononyl phthalate,DINP)3种最常见PAEs的最大残留限量分别为1.5、0.3、9.0 mg/kg[11]。
PAEs与塑料制品中的聚合物是以不稳定的非共价键形式结合的,因此很容易由塑料制品中迁移出来,造成环境,特别是食品的污染。食品是人类摄入PAEs的主要来源,食品中的PAEs除了从环境吸收外,主要来自包装、容器等食品接触材料中的迁移[12,13]。葛成相等[14]在对合肥市市售22件白酒进行PAEs的检测中发现邻苯二甲酸二丁酯(DBP)含量超标率为9.09%,DEHP含量超标率为22.7%。陈志民等[15]研究发现DBP和DEHP在植物油中的总检出率为30.7%,其中DBP的超标率为10.0%。左蓓等[16]的研究表明DBP和DEHP在油脂中的迁移量与存储时间和油桶中2种物质含量相关,存储时间越长,油桶中含量越高,迁移量越大。
发展简单、快速、准确、高灵敏的PAEs检测技术,实现对PAEs的高效监控,对有效防止塑化剂污染,保障食品安全具有非常重要的意义。食品中PAEs的检测主要分为2个部分:(1)样品中PAEs的分离提取,主要提取方法有液液萃取、固相萃取、磁性固相微萃取、凝胶渗透色谱等[17]。(2)仪器分析检测,主要包括传统大型仪器检测和快速检测,以传统大型仪器检测为主。然而,PAEs种类繁多,食品基质成分复杂,为食品中PAEs的高效检测带来了极大挑战。如何有针对性的选择合适的检测技术,实现对PAEs的快速准确测定,是确保食品安全健康的重要保障和现实需求。因此本文总结了近年来食品中PAEs检测技术的研究进展,以期为食品中PAEs检测技术的发展和应用提供研究思路和方向。
1 食品中PAEs的前处理方法
对食品中的PAEs进行定量分析之前,一般要对其进行提取和净化处理。目前常用的前处理方法有液液萃取、固相萃取、磁性固相微萃取、凝胶渗透色谱等[18]。其中,液液萃取利用的是相似相溶原理,其操作简便、检出限低、精确度高,可用于对不同种类食品中PAEs的提取。液液萃取常用的有机溶剂有正己烷、乙腈、乙酸乙酯、二甲基亚砜、甲醇等[2]。金月[19]利用正己烷对白酒中的DEHP、DBP和DINP进行萃取,并直接取上清萃取液进行定量测试,得到了对3种塑化剂均有较高的回收率。然而液液萃取需要用到大量有机溶剂,对人体健康带来危害。固相萃取是近年来发展起来的一种样品预处理技术,操作步骤一般为活化、上样、淋洗和洗脱。与液液萃取相比,固相萃取更节省溶剂,操作更加简单,分析物的回收率较高,但是该方法所用萃取柱成本较高。洪月玲等[20]采用分子印迹固相萃取方法对食用油中提取的9种PAEs进行净化,所得加标回收率均达到了理想水平。固相微萃取是在固相萃取技术上发展起来的一种微萃取分离技术,是一种集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取技术。磁性固相微萃取以磁性物质为吸附剂,利用外加磁场达到目标物与基质分离的目的,操作便捷,省时快速。冯艺洋等[21]合成了磁性纳米材料Fe3O4-@DAPF,并将其作为吸附剂对水样中的DEHP进行吸附富集,从而实现了对DEHP的低检出限测定。固相微萃取对目标物的回收率和精密度要低于液液萃取,且也无法高效彻底分离一些极性差异不明显的物质(如植物色素等)。凝胶渗透色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布,同时根据所用凝胶填料的不同,可分离脂溶性和水溶性物质。杨欣等[22]用凝胶渗透色谱净化了从8种膳食样品提取出的16种PAEs。该方法操作简便,快捷,但成本较高。
2 传统大型仪器检测法
大型仪器检测法有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[23,24,25]、气相色谱法(gas chromatography,GC)[26,27]、气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[28,29]、液相色谱-质谱联用法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HLPC-MS)[30]、傅立叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)[31]等。
2.1 高效液相色谱法
高效液相色谱法是普及度最高的液相分析方法,具有操作简单、测定快速、灵敏度高、灵活性好、适用范围广等诸多优点,可用于检测热不稳定性和易挥发性有机化合物。如LIANG等[32]采用高效液相色谱法对油脂中DEHP、邻苯二甲酸丁基苄酯(butyl benzyl phthalate,BBP)等多种PAEs进行了测定,得到了1.24～3.15μg/L的检出限。WANG等[33]采用高效液相色谱法对水体中的PAEs进行检测,检出限低至0.03～0.08μg/L,适用于PAEs的痕量测定。黄明元等[25]及蔡英翔等[34]利用高效液相色谱法测定了白酒中的多种PAEs。
高效液相色谱法的条件选择十分繁琐,测试前的准备工作消耗大量时间,且测试过程会使用大量乙腈等有害物质,并非是食品中PAEs检测的最佳选择。
2.2 气相色谱法
气相色谱法适用于性能相近的物质或多组混合物,尤其是易挥发有机化合物的定性、定量分析,具有灵敏度高、选择性好、效能高、应用广泛、检出限低等优点,在PAEs的检测中应用广泛。张修景[35]利用气相色谱法测定了白酒中BBP的含量,得到检出限为0.003 mg/kg,远小于我国规定的最大残留量1.5 mg/kg,样品的加标回收率在98.2～101%之间,该方法表现出良好的实际应用前景。但是该方法在测定样品过程中存在假阳性的可能,且稳定性和重现性较差。
2.3 气相色谱-质谱联用法
PAEs种类繁多,且各种PAEs分子的理化性质相似,依靠单一检测手段难以实现对复杂样品中全部PAEs的定性、定量分析。采用液相色谱、气相色谱与其他检测技术相结合的方法有望克服单一检测手段的局限,实现对样品中多种PAEs的分析,同时保证检测的准确性和可信度。
GC-MS技术结合了气相色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度,可有效弥补气相色谱在稳定性和重现性上的不足,不仅具有好的分离性能而且具有很好的定性能力,随着科技的发展,GC-MS方法逐步取代了GC的方法,适用于对复杂有机物进行高效的定性、定量分析。同时GC-MS是GB5009.271—2016中使用的食品中PAEs检测方法,也是目前应用最为广泛的PAEs检测法[36,37]。徐皓等[38]建立了白酒中DBP和DEHP的HPLC与GC-MS检测法。通过对2种检测技术的对比分析,发现HPLC法检测成本较低,前处理较费时,可满足一般白酒厂日常检测需求,而GC-MS法在检测精密度、回收率方面要优于液相色谱法,且其步骤简短,易操作,前处理时间较短,可满足对塑化剂高精度检测的要求。赵纪莹等[39]采用GC-MS技术对2018年河南省市售333份食物油样品的PAEs污染状况进行了调查,发现DBP和DEHP的检出率分别为44.4%、50.2%,二者超标率分别为21.6%和3.6%,相关结果为植物油中PAEs的污染状况提供了有效参考。相似的,李思果等[40]采用GC-MS对2014—2016年市售白酒中PAEs的检查结果显示,3年中PAEs的超标率分别为8.13%、2.67%、3.33%。唐晓伟等[37]建立了以GC-MS为主的蔬菜中3种PAEs检测技术,为蔬菜中PAEs残留的研究奠定了基础。虽然GC-MS检测技术拥有很多其他方法不可比拟的优点,但是其运行成本较高,PAEs在色谱柱及离子源中残留也较高,易引起色谱柱和离子源的污染。
2.4 液相色谱-质谱联用法
与GC-MS相似,HPLC-MS技术是将高效液相色谱法与质谱法相结合,拓宽了高效液相色谱法的检测范围,是一种集高分理性、高选择性和高灵敏度于一体的检测方法。HPLC-MS可用于测定GC-MS难以区分的物质,如DINP和邻苯二甲酸二异癸酯(di-iso-decyl phthalate,DIDP)具有多种同分异构体,在GC和GC-MS的色谱图中为五指峰,不容易准确定量。徐敦明等[41]采用HPLC-MS进行测定时,DINP只有一个峰,易于实现定量检测。此外,HPLC-MS亦适用于多种PAEs的高通量测定,邵秋荣等[30]利用HPLC-MS法测定了酒中23种PAEs的残留量,检出限为0.1 mg/kg,远低于国家限量标准。23种PAEs的加标回收率为87～102%,证明了采用HPLC-MS技术对食品中PAEs多残留检测的可行性。HPLC-MS方法灵敏度高,定性定量准确,近年来在痕量有机物的检测中应用越来越广泛,但是HPLC-MS方法仍然存在HPLC检测法中操作复杂的缺点,同时其所用设备昂贵,在食品污染物的检测应用中受限。
2.5 傅立叶变换红外光谱法
除了有上述检测方法之外,傅立叶变化红外光谱法也被应用于PAEs的检测。傅立叶变化红外光谱具有分辨率高、检测快速等优点,在有机化学、无机化学、材料科学、医药和环境等领域有较多应用。俞雄飞等[31]利用傅立叶变换红外光谱对PAEs进行了快速鉴定。该方法的不足之处在于灵敏度较低、基体干扰较大,需要对样品进行较高的分离提纯,因此在食品中污染物的检测中应用较少。
3 快速检测法
大型仪器检测法在食品中PAEs的检测中表现出灵敏、快速、准确等优点,但仍存在很多不可避免的问题,包括样品前处理复杂、仪器昂贵、需要专业人员操作、有机溶剂用量大等,无法满足对食品中PAEs实时原位快速检测的迫切需求。因此快速检测技术应运而生,主要有免疫检测法[42,43,44]、荧光法[45,46,47]、电化学检测法[48,49]、表面增强拉曼光谱法(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)[50,51]等。
3.1 免疫检测法
免疫检测法是利用抗原与抗体的特异性识别能力对目标分子进行快速的定性、定量分析。根据检测模式、载体和标记物的不同,免疫检测技术可分为酶联免疫分析法、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)免疫分析法、免疫亲和层析分析法等。酶联免疫法是研究最多的PAEs免疫分析法,SUN等[52]制备了生物素化的DBP多克隆抗体,建立了一种高灵敏的DBP生物素-链酶亲和素酶联免疫检测法,该方法对DBP具有很高的检测特异性(<4%),检测浓度范围为0.45～7.06 mg/L,检测限为5 ng/L,对饮料和饮用水中的检测回收率在89.5%～109.5%之间。ZHANG等[53]提出了一种新型的竞争性酶联免疫吸附法来检测DBP,该方法基于溶解的Ag+对牛血清白蛋白催化的抑制作用来提高检测灵敏度,降低DBP的检测限,比常规的酶联免疫吸附试验降低了16倍。相对于其他免疫检测技术,PCR分析法具有较低的检出限和较高的灵敏度,SUN等[43]建立一种超灵敏的高通量免疫PCR分析方法,用于对食品中邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)的快速实时检测。研究者将免疫方法与PCR技术相结合,大大提升了对DEP的检测能力,其检测浓度范围达到4 pg/L～40 ng/L,检出限为1.06 pg/L,该工作为食品中痕量PAEs的测定提供了方法学借鉴。免疫亲和层析技术是发展较为成熟的免疫检测技术,现已有基于免疫亲和层析技术的PAEs检测卡的商业化生产[54]。
免疫检测技术的抗干扰能力较差,易出现假阳性结果,其核心试剂抗体属蛋白类物质,易受温度、PH等的影响而失活。
3.2 荧光法
荧光法的原理是利用羟基自由基进攻PAEs,使其转变成具有荧光性的羟基邻苯二甲酸纳,通过对荧光强度的测定可间接得到PAEs的含量。此外,可引入外源荧光材料,通过信号转换实现PAEs的测定。KIM等[55]以Po Po3为外源荧光材料,构建对多种PAEs(邻苯二甲酸二甲酯(dimethylphthalate,DMP)、DEP、DBP、DIBP、BBP、DEHP等)快速检出的适配子荧光传感器,可在30 s内完成对目标分子的定量测试。在对实际样品的检测中,得到了与GC-MS相关媲美的检测结果。WANG等[56]报道了一种利用氨基核酸适配子修饰碳量子点的DBP荧光检测方法,该方法在对酒中DBP的高选择性和高灵敏检测中得到了成功应用,其检测回收率为93.2%～112.4%。在对痕量PAEs的测定中,常将荧光检测方法与免疫检测法相结合,以提高检测准确性和灵敏度。CUI等[57]成功合成了含氨基的邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)半抗原,并制备了抗邻苯二甲酸-牛血清白蛋白的多克隆抗体。以该多克隆抗体为基础,首次建立了一种快速、灵敏的间接竞争性荧光免疫分析法用以检测食用油样品中的DIBP。其检测浓度范围为10.47～357.06 mg/L,检出限为5.82 mg/L,交叉反应率小于1.5。ZHANG等[45]开发了一种高灵敏的竞争性间接荧光免疫分析法,用以实现对邻苯二甲酸二己酯(dicyclohexyl phthalate,DCHP)的特异性检测。该方法以异硫氰酸荧光素为荧光标记物,结合DCHP兔源多克隆抗体建立了DCHP的荧光免疫分析法,达到了0.1～200 mg/L的检测范围和0.05 mg/L的检测限。
采用荧光检测法对非荧光性物质进行检测时,常常涉及荧光物质的修饰,操作步骤较为繁琐,成本较高。此外,荧光检测结果难以长期保存。
3.3 电化学检测法
电化学检测法是现今发展最快速的食品安全检测技术之一,是一种根据待检溶液中物质的电化学性质及其变化规律对物质组分进行定性和定量检测的仪器分析手段,具有检测快速、成本低廉、操作简单、灵敏度高、选择性好、便于实现对液态样品的实时原位检测等诸多优点。根据电极识别元件的不同,电化学传感器可分为适配体电化学传感器、分子印迹电化学传感器、电化学免疫传感器、纳米材料电化学传感器等。WU等[58]采用指数富集配体进化技术筛选了对DBP特异性结合的适配体,以适配体为DBP捕获元件,进一步构建了DBP的电化学适配体传感器,实现了对DBP的选择性高灵敏检出,为塑化剂适配体的筛选和选择性检测提供了新的方法。陶强等[59]以DINP为检测目标物,制备了DINP分子印迹聚合物,将之修饰于玻碳电极表面得到了可对DINP选择性高灵敏检出的分子印迹电化学传感器。该传感器可直接用于市售白酒样品中DINP的现场检测,无需样品前处理,其检测浓度范围为50 nmol/L～1μmol/L,检测限为27 nmol/L。适配体、分子印迹聚合物作为识别或富集元件在电化学检测中具有其局限性,如适配体的修饰和分子印迹聚合物的低导电性等。对PAEs具有选择性催化能力的功能纳米材料常代替上述识别材料或与其相集合,用于对食品中PAEs的快速检测。XIAO等[48]构建了一种以二茂铁树枝状聚合物-氧化石墨烯修饰玻碳电极的邻苯二甲酸二(2-甲氧基)酯(dimethoxyethyl phthalate,DMEP)电化学传感器。其中,树枝状高分子结构为氧化石墨烯的负载提供了致密的基底,氧化石墨烯为二茂铁树枝状聚合物氧化还原探针的沉积提供了大的比表面积,并提高了复合材料的导电性。该传感器依托优异的纳米材料实现了对白酒中DMEP的成功检测,检测范围为0.06～1200μmol/L,最低检出限为0.04 mol/L。LIANG等[49]研制了一种新型的简单、无标记的DBP电化学阻抗免疫传感器,该传感器的检出限较低(7μg/L),选择性较高,抗环境干扰能力较强,具有对实际样品进行实时原位检测的潜力。然而,如上文免疫检测法所述,酶的稳定性较低,易失活。
电化学检测技术具有原位检测的优点,但仅适用于液态样品,且要求样品具有良好的导电性。开发新的电极材料与电极形式,提高电化学检测的稳定性和抗干扰能力是实现食品中PAEs快速原位检测的有效途径。
3.4 表面增强拉曼光谱法
SERS属于分子振动光谱,可反映分子的特征结构,具有对目标分子选择性识别的作用,被广泛应用于生物医学、环境检测、化学成分分析、生物化学传感、疾病诊断等研究领域[60]。SERS检测条件温和、操作简单且无需样品前处理,具有原位快速检测的潜力,受到国内外研究者的广泛关注。金属元素金、银、铂、铷等对SERS具有显著的增强效果,常被用于对食品中PAEs的SERS检测。周亚茹等[61]利用液-液自组装技术制备了金纳米三棱柱,其在乙醇与正己烷之间紧密排列形成膜状结构,再以硅片为其载体可制备便携式SERS基底,该基底对BBP和DEHP均达到了较低的检出限,分别为0.1 mg/kg和0.05 mg/kg。利用该SERS基底成功实现了对酒中BBP的检出。王欣如等[62]以金纳米三角片为模板制备了金-银核层纳米结构(Au@Ag纳米三棱锥),并以该材料为SERS活性基底,结晶紫为探针,实现了对酒中BBP和DEHP的高灵敏检测,检测限分别为1 nmol/L和100 nmol/L。胡小燕等[63]采用液-液界面自组装技术,制备了金纳米棒二维SERS基底膜(2D-SERS),并以结晶紫为探针分子对所构建的2D-SERS进行了测试,结果表明其对BBP的检测具有良好的重现性和较高的灵敏度,检测限可达50 nmol/L,该方法被成功应用于市售白酒中中毒剂量BBP的检测,表现出潜在的实际中应用性。拉曼散射强度容易受光学系统参数等因素的影响,且易出现不同振动峰重叠的现象,影响测试准确性。
4 食品中PAEs检测的难点
尽管食品中PAEs的检测技术已有大量报道,如何实现PAEs的高效监控,保障食品安全仍然面临诸多挑战:
样品前处理工作复杂,无法实现大批量、现场快速检测。
快速检测技术有待加强。不仅要提高快速检测方法的灵敏度,还应该扩大快速检测方法的应用范围。
食品中17种常见的PAEs的限量标准尚未公布,会影响实验者对检测结果的判定,也不利于市场监管。因此合理制定限制PAEs的标准法规也是目前急需解决的问题。
5 结束语
食品中PAEs的有效监控对防止食品污染,保障人们饮食安全具有重要的现实意义。本文对目前常用的食品中PAEs检测技术进行了总结分析。传统大型仪器检测法具有检测灵敏、准确度高的优点,同时也存在设备昂贵、仪器操作复杂等不足之处;快速检测技术具有检测快速、成本低廉、适于原位检测的优点,也具有准确性低、适用范围受限等缺点。食品种类繁多,不同种PAEs物理化学性质亦有差异,根据不同的检测需求灵活选择合适的检测方法,或者采用多种检测技术相结合的方式是实现食品中PAEs高效检测的有效手段。同时,发展更为完善的PAEs检测新模式并加以推广应用将成为未来食品中PAEs检测的主要发展方向。
